-
Konfokální mikroskop odkazuje na druh speciálního optického mikroskopu, který může zaznamenávat optické řezy.
Osvětlením a pozorováním jediného limitního bodu difrakce je v laserovém konfokálním systému realizováno optické krájení. To vyžaduje, aby oba paprskové segmenty měly stejné zaměření, takže jsou „konfokální“. Na rozdíl od obrázků širokého pole nemají konfokální obrazy žádné rozostření. To je samo o sobě výhoda, protože hluboký obraz vzorku je jasný a bohatý na detaily. Nejdůležitější výhodou je však jeho trojrozměrný vizualizační potenciál s mikroskopickými rysy. Po získání obrazové sekvence podél stacku Z, 3D objekt je rekonstruován a zobrazen počítačem.
- Konfokální osvětlení
Osvětlení zdroje bodového světla je realizováno zaměřením zdroje světla na malý otvor (dírku) a poté jej zaostřením na vzorek. Když je clona dostatečně malá, bod osvětlení je omezen pouze difrakcí, nikoli geometrickými parametry světelného zdroje a clony. Obyčejný zdroj světla je velký zdroj povrchu světla, takže je nemožné jej zaměřit na difrakční limitní místo. Proto, ačkoli je propustnost velmi nízká, je tento druh zaměřeného osvětlovacího světla stále velmi nezbytný (pro tradiční zdroje světla).
Obrázek 1: Osvětlení pro konfokální zobrazování. Světlo ze světelného zdroje (LS) je zaměřeno na dírku osvětlení (PI) a poté vstupuje do vzorku S ..
Laser jako zdroj světla má velmi vysokou kolimaci (světlo v dobrém laseru je „extrémně paralelní“). Proto může být laser zaměřen na místo s omezením difrakce prostřednictvím jediného čočky bez použití dírky. Většina konfokálních mikroskopů proto nemá žádnou dírku osvětlení. Kvalita světelného místa závisí na kvalitě paprsku laseru. Pokud kvalita není dobrá, můžete také vložit světelný díl. Laser je obvykle spojen s konfokálním mikroskopem prostřednictvím optického vlákna. Tato vlákna sama o sobě působí také jako dírky.
Fokotalizace a vysoká hustota energie laseru z něj činí ideální světelný zdroj pro konfokální mikroskop. Koherence laseru není požadovaným rysem konfokálního výkonu. Naopak je to výzva pro optické návrháře, protože to způsobí falešné interferenční vzorce, takže jsou zapotřebí pečlivé konstrukční strategie.
Kromě toho má skutečnost, že tradiční laser vydává pouze jednu barvu (laserová „linka“), má svá vlastní omezení. Při multifluorescenčním zobrazování a měření je zapotřebí komplexního multi-laserového uspořádání. Bílý laser obratně řeší problém vícebarevného zobrazování.
Obrázek 2: Srovnání konfokální (pravá plocha) a nekonfokálního zobrazování. V Feulgen obarveném myši trofoblastu. Mnoho informací o nekonfokálních obrázcích nepochází z fokální roviny. Konfokální optika eliminuje všechny fuzzy faktory a objasňuje strukturu.
Konfokální detekce
Většina detektorů má poměrně velkou citlivou oblast (trubky fotomultiplikátoru jsou obvykle několik čtvercových centimetrů). Konfokální optika potřebuje snímání bodu. Proto je nutné provést detekci bodů vložením malého otvoru (dírky) do světelného paprsku. Zaostření světla vzorku na dírku, sběr a zaznamenávání vysílaného světla.
Protože difrakční vzorec závisí na numerické apertuře a vlnové délce, je nutná detekce dírky. Proto, když se tyto parametry změní, musí být velikost dírky upravena.
Když se objektiv objektivu změní (obvykle se změnou numerického otvoru), moderní konfokální skenovací mikroskop automaticky změní průměr dírky vhodně. Proto jsou dírky obvykle navrženy jako dvojité nebo vícevrstvé otvory.
Ve skutečnosti odpovídající velikost dírky závisí nejen na vlnové délce a numerické apertuře, ale také na vnitřním zvětšení optických prvků v mikroskopu.
Proto je nejen nežádoucí, ale také nesprávné přímo porovnat průměry dírky v mikroskopech s různými vzory. Pokud průměr dírky není nastaven na optimální hodnotu, nebude systém schopen provádět hladce optické krájení (tj. Přenosu rozostření), nebo zbytečně odříznout intenzitu bez získání další kvality optického krájení (což má za následek zbytečné šumové obrazy).
Obrázek 3: Detekce při konfokálním zobrazování. Světlo ze vzorku S je zaměřeno na pozorovací dírku (PO) a poté na detektor DE.
Optická cesta konfokálního skenování
Cesta konfokálního paprsku v systému konfokálního skenování je pouze kombinací osvětlení bodového zdroje a detekce bodů. Tuto kombinaci lze použít jako optický nůž. Do senzoru lze přenést pouze fotony z ohniskové roviny. Zatímco všechny fotony z jiných míst jsou odfiltrovány. Optické krájení je realizováno pomocí „prostorového filtru“.
Protože se v daném čase objeví pouze jedno místo „konfokální“ zobrazování, je potřeba skenovacího zařízení k přesunu místa na poli objektu v režimu mřížky. Optické zrcadlo je obvykle nainstalováno na skenovacím motoru a používá se k provedení postupu skenování. V době potřebné k skenování plného snímku (obvykle) 1 024 řádků je probíhá úzkost. Vylepšení byla dosažena zavedením vysokorychlostního skeneru (rezonanční skener), který skenuje 8, 000 nebo více řádků za sekundu.
Pouze pod technologií mikroskopu odraženého světla může být dosaženo dobrého optického řezu. To je jeden z důvodů intenzivního vývoje fluorescenční mikroskopie za posledních 20 let (další důvody zahrnují vynález imunofarbení, hybridizace DNA, fluorescenční biosenzor, kvantové tečky a fluorescenční protein).
Obrázek 4: Zleva doprava: 1.. Osvětlovací kužel nejen vzrušuje fluorescenční barvivo v ohniskové rovině, ale také ho vzrušuje nahoru a dolů. Zde představoval zelený dvojitý kužel. 2.. Emisní dírka účinně zachycuje světlo emitované z ohniskové roviny. 3. Kromě toho světlo z pod ohniskovou rovinou neprochází dírkou. 4. V konfokálním systému dosáhne detektoru pouze světlo ze vzorku. Detekce dírky účinně odmítne jakékoli světlo z jiných oblastí. Nakonec je získána skutečná optická část.
